Революция в микроскопии: ученые смогли увидеть отдельные атомы белка

На обложке статьи – визуализация молекулы белка апоферритина, полученная путем криоэлектронной микроскопии.

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) – новаторская технология получения трехмерных изображений молекул – вышла на беспрецедентно высокий уровень разрешения, впервые в своей истории выделив отдельные атомы белка.

Исследование апоферритина

Это историческое достижение удалось двум группам ученых из Германии и Соединенного Королевства. Результаты исследований были опубликованы на сервере препринтов bioRxiv 22 мая.

Чтобы вывести крио-ЭМ на уровень атомарного разрешения обе команды провели опыты над белком апоферритина, который связывает железо. Выбор ученых пал именно на этом белке из-за чрезвычайно высокой стабильности его молекул. Группа из Великобритании (а это ученые под руководством Сьорса Шереса и Совет Арическу, структурных биологов Лаборатории молекулярной биологии Совета медицинских исследований в Кембридже) использовала технологию, снижающую уровень шума от отдельных электронов, которые не попали в молекулу белка, а также более чувствительную камеру для обнаружения электронов.

Как результат, ученые совершили настоящий научный прорыв и получили четкие изображение структуры молекулы белка методом крио-ЭМ: немецкий коллектив (под руководством Хольгера Штарка, биохимика и электронного микроскопистов из Института биофизической химии им. Макса Планка в Геттингене) – с разрешением 1,25 ангстрем (1 ангстрем составляет 10 ^-10 метра или одну десятимиллионную часть миллиметра), а коллектив Шереса и Арическу – с разрешением 1,2 ангстрем, что позволило увидеть отдельные атомы водорода не только самого апоферритина, но и молекул воды вокруг него. Предыдущий рекорд разрешения изображения структуры белка составил 1,54 ангстрем.

Исследование ГАМК _А рецепторов

Кроме того, Шерес и Арическу также испытали свой усовершенствованный метод крио-ЭМ для исследования упрощенной формы белка рецептора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК _А рецепторов), который находится в мембране нейронов и служит мишенью для общих анестетиков, успокаивающих лекарств и многих других препаратов. В прошлом году группа Арическу визуализировали структуру этого белка с разрешением в 2,5 ангстрем, однако сейчас, применив улучшенную технологию, ученым удалось получить изображение с разрешением в 1,7 ангстрем.

Увеличение разрешения даже на пол ангстрем настолько расширяет представление об исследуемом белке, что ученые сравнивают это с открытием новой Вселенной. Так, полученная Шересом и Арическу структура ГАМК _А рецептора обнаружила ранее невиданные детали этого белка, в частности, молекулы воды в «карманах», где находится гистамин. Это открытие имеет важное значение для структурно-ориентированного конструирования лекарств, поскольку показывает, как лекарства могут вытеснять молекулы воды, открывает путь для создания медицинских препаратов с меньшим количеством побочных эффектов.

Понятие крио-ЭМ и история ее развития

Крио-ЭМ – это технология, позволяющая определить структуру быстрозамороженных образцов веществ, обстреливая их электронами и записывая полученные в результате этого изображения. Возникла она несколько десятилетий назад и за время своего существования претерпела существенного прогресса. Если в начале 2000-х годов максимальное разрешение изображений, полученных с применением крио-ЭМ, составляла примерно 10 ангстрем (т.е. 1 нанометр), то сегодня она достигла атомарного уровня в около 1,2 ангстрем.

Снимок апоферритина с разрешением 1,2 ангстрем, полученный с помощью крио-ЭМ:

Начало «революции разрешения» пришлось ориентировочно на 2013 год, чему способствовал развитие технологии обнаружения отраженных электронов и программного обеспечения для анализа изображений. Благодаря этому изображение структур белков, полученных с помощью крио-ЭМ, существенно приблизились по четкостью к изображениям, полученным методом рентгеноструктурного анализа – более древней технологии, создающей визуализации структур с дифракционной картинами, возникающих в результате бомбардировки белковых кристаллов рентгеновскими лучами. Однако, несмотря на дальнейшее совершенствование аппаратуры и программного обеспечения крио-ЭМ и, соответственно, уменьшения смазывания, для получения структур молекул с атомарной разрешением ученые все же были вынуждены полагаться преимущественно на рентгеноструктурный анализ.

Начало гегемонии крио-ЭМ

Научный прорыв, осуществленный лабораториями Штарка, Шереса и Арическу, выводит крио-ЭМ на видное место среди технологий для получения изображений трехмерных структур белков и большинства структурных исследований в целом, считают ученые. Ключевым преимуществом крио-ЭМ является то, что для нее нужен только очищенный раствор испытуемого белка, в то время как для структурного анализа белок необходимо кристаллизовать, что может занять месяцы или даже годы, а многие из весомых белков для медицины вообще не образуют пригодных для изучения кристаллов.

Визуализация достаточно точная, чтобы однозначно определить местонахождение отдельных атомов в молекуле белка, при разрешении около 1,2 ангстрем. Впервые преодолев этот барьер, крио-ЭМ открывает возможности для беспрецедентно детального изучения механизма работы белков, которые сложно исследовать с применением других технологий, в частности рентгеноструктурного анализа.

С большой вероятностью крио-ЭМ будет пользоваться большим спросом среди фармацевтических компаний, которым понадобятся структуры молекул с атомарной разрешением. Эти структуры помогут исследователям изучить работу ферментов и определить препараты для блокирования их активности, а также понять, как функционируют белки в здоровом и больном организмах, что позволит усовершенствовать лекарственные средства, минимизировав их побочные эффекты.

Предел возможностей крио-ЭМ

Соединив наработки лаборатории Штарка и группы Шереса и Арическу, потенциально можно повысить разрешение крио-ЭМ до около 1 ангстрем, но не слишком дальше. Достижения разрешения в менее 1 ангстрем, хотя и можно допустить в теории, однако на практике невозможно. Получение с помощью крио-ЭМ настолько детальной структуры молекулы даже с использованием современных передовых технологий займет несколько сотен лет, необходимых для сбора данных, и может требовать колоссального количества вычислительных ресурсов и емкости памяти.

Исследования:

• Single-particle cryo-EM at atomic resolution. DOI: 10.1101 / 2020.05.22.110189;
• Revolutionary cryo-EM is taking over structural biology. DOI: 10.1038 / d41586-020-00341-9;
• Breaking the next Cryo-EM resolution barrier – Atomic resolution determination of proteins! DOI: 10.1101 / 2020.05.21.106740.