Споры бактерий

Вирусолог Андрей Летаров о проклятых пастбищах, этапах формирования спор и тестировании гипотезы панспермии.

Споры бактерий — это совершенно удивительное явление. С ним связано большое количество неприятностей, с которыми сталкивается человечество на протяжении практически всей своей истории. Впервые это явление было открыто двумя микробиологами, один из которых принадлежит к числу основателей биологии как науки, и звали их Фердинанд Кон и Роберт Кох. Фердинанд Кон был учителем Роберта Коха, они общались по поводу своих открытий, и по этой причине их статьи были опубликованы в одном и том же номере журнала. Мы можем считать их сооткрывателями.

Кон открыл споры у сенной палочки (Bacillus subtilis). А Роберт Кох занимался изучением жизненного цикла возбудителя сибирской язвы. Это было чрезвычайно опасное и авантюристическое предприятие, поскольку в тот момент никакой микробиологической техники, в том числе техники безопасной работы с бактериями и культурами, не существовало. Все это он создавал в процессе своего, как он считал, медицинского исследования, начатого с целью объяснить причину существования так называемых проклятых пастбищ — зеленых лугов, на которых вроде бы все в порядке, но овец, которых туда выгоняют, через некоторое время поражает сибирская язва. «Проклятие» пастбищ могло существовать в течение определенного количества лет, даже если в течение этих лет овец, уж тем более сибиреязвенных, туда не выгоняли. Пытаясь разгадать загадку, Роберт Кох, уже имевший в руках выделенную им культуру возбудителей сибирской язвы, обратил внимание, что в старых культурах в клетках можно увидеть ярко светящиеся под микроскопом блестящие образования. Светятся они не потому, что излучают свет, а потому, что его преломляют. Как он смог пронаблюдать, потом они превращаются в нормальные вегетативные клетки и могут вызвать заболевание. Это и были эндоспоры возбудителя сибирской язвы.

Споры возбудителя сибирской язвы относятся к числу наиболее устойчивых эндоспор бактерий. Они могут переносить как минимум десятиминутное кипячение и сохраняться в почве до нескольких десятков лет. Хотя это экстремальные сроки, потому что за десятки лет их там останется немного, но какие-то могут выживать. Поэтому сибиреязвенные могильники сохраняют как режимный объект в течение очень длительного времени и не разрешают их использовать. По этой же причине сибирская язва оказалась популярным агентом биологического оружия и биологического терроризма, поскольку, в отличие от живых культур, споры сибирской язвы достаточно легко сохраняются во внешней среде. Ими довольно просто снарядить какой-нибудь снаряд и прочие смертоносные изделия.

Помимо опасных возбудителей довольно много бактерий могут образовывать такие споры, и это создает проблемы, например, при сохранении консервированной продукции. Всем известна история с заболеванием, которое называется ботулизм и связано с тем, что в консервах выживает небольшое количество спор почвенной клостридии (Clostridium botulinum) — это опасный яд, токсин. Сама по себе эта клостридия для человека неопасна, а вот ее белковый токсин вызывает тяжелейшее отравление. Но, помимо отравления, мы можем просто наблюдать порчу более-менее хорошо приготовленных консервов по этой же причине: не удалось до конца убить споры. Чтобы это сделать, консервы, среды или инструментарий врачей обычно подвергают стерилизации паром под давлением: все-таки при температуре 120 °C и давлении в одну атмосферу, причем в условиях высокой влажности, споры выживать не могут.

Если нет возможности сделать это, есть некий трюк, придуманный Тиндалем, физиком конца XIX века. Идея была очень простая: вы можете взять питательную среду — лабораторные среды или еду, — простерилизовать ее при умеренных температурах (например, прокипятить на водяной бане) и дать постоять в теплом месте несколько часов или ночь. За это время споры, почувствовав большое количество еды, начнут прорастать, и тогда можно будет их убить повторным кипячением. Повторив это два или три раза, можно будет добиться полной стерильности вашего материала.

Как же это получается? Чтобы сделать настолько устойчивую, гиперустойчивую форму клеток, недостаточно усилий самой клетки, она не может замуровать себя настолько эффективно изнутри. Дело даже не в том, что спора содержит несколько дополнительных оболочек по сравнению с обычной вегетативной клеткой, а в том, что ее внутреннее содержимое компактизировано, высушено и заполнено специальным веществом — кальциевой солью дипиколиновой кислоты, которая забирает на себя почти всю воду. То есть к концу формирования споры ее метаболизм должен фактически полностью остановиться. За счет этого достигается сверхвысокая устойчивость, потому что большая часть повреждений — что от тепла, что от радиации — возникает не путем прямого повреждения биологических молекул, а так или иначе опосредовано водой. Чтобы создать такую капсулу времени, спору, необходимо усилие другой живой клетки, поэтому этот процесс происходит не с двумя соседними клетками, например, в цепочке, а внутри, в цитоплазме пока еще живой материнской клетки, спорангии.

Процесс начинается как деление клетки, но несколько необычное, ассиметричное. Клетка делится не посередине, как обычно, а примерно в соотношении один к трем. Четвертинка, которая таким образом отделяется, будет спорой — ее можно называть проспорой. Оставшаяся часть — это материнская клетка, спорангий. Это деление немного отличается по механике от стандартного клеточного деления. Клетка строит новую цитоплазматическую мембрану, происходит впячивание мембраны, и в итоге она окончательно разделяется. Настоящие эндоспоры пока описаны только у грамположительных клеток. Внешняя оболочка у грамположительных клеток представляет собой один мощный слой муреина (пептидогликана), но внешней мембраны у них нет. Это важно, потому что было бы непонятно, как ее потом поместить внутрь.

Клетка делится в отношении три к одному, и при этом в ней имеется две копии ДНК. Есть специальные механизмы, которые обеспечивают соответствие числа копий именно этому числу. Их должно быть ровно две, а не две с половиной или три. Они выстраиваются вдоль оси клетки длиной в виде тяжа. Очевидно, что в проспору попадает примерно 30% одного из таких тяжей, то есть в ней пока нет полного комплекта ДНК.

С этого момента включается процесс различия в экспрессии генов в материнской клетке и в проспоре. С точки зрения формального определения это классические дифференцированные клетки. Они обладают разными паттернами экспрессии. Значит, чтобы обеспечить разные паттерны экспрессии, клетки используют сигма-факторы — специальные субъединицы РНК-полимеразы, которые позволяют ей опознавать новые сигналы старта транскрипции. Стандартная РНК-полимераза со стандартным сигма-фактором считает началом транскрипции такую последовательность. Если мы какому-то числу этих молекул дадим дополнительный фактор, заменим стандартный фактор на альтернативный, то они будут узнавать совсем другие гены. Добавив один белок, мы можем включить сразу очень много разных генов — эта стратегия используется. Происходит скоординированное переключение сигма-факторов. В результате клетки понимают, кто из них проспора, кто из них материнская клетка. Специальный белок за счет энергии АТФ с усилием помещает одну полную копию ДНК в будущую проспору, и деление завершается.

Таким образом, внутри общей оболочки оказываются две клетки, окруженные мембранами. И дальше происходит совершенно фантастический процесс — поглощение. Края мембраны материнской клетки начинают ползти вдоль оболочки, проходят между мембраной проспорой и оболочкой, полностью закрывают ее и поглощают. Окруженная мембраной проспора оказывается прямо внутри цитоплазмы материнской клетки. Они начинают обмениваться сигналами, координируют свои усилия, поскольку существует несколько стадий работы по образованию споры: сначала необходимо включить одну сигма-субъединицу в материнской клетке, потом другую в проспоре.

Далее из проспоры следует сигнал, что все в порядке, и происходит переключение на следующую стадию. В процессе этого строится несколько специальных дополнительных оболочек. Сама проспора окружается своим пептидогликаном — это будет будущая клеточная стенка клетки после прорастания. Поверх строится дополнительный слой, так называемый кортекс — это тоже пептидогликановый слой, но его химический состав немного отличается от стандартного. Дальше строятся мощные белковые оболочки. Существует специальный, очень интересный процесс морфогенеза. Сначала откладываются одни белки, и они образуют место для присоединения других, поэтому получается такая многослойная оболочка. Иногда сверху добавляются разные декоративные структуры, порой образующие что-то, похожее на перья птиц. По-видимому, это нужно, чтобы споры прилипали к разным объектам среды. Иногда на завершающих стадиях образуется огромный белковый кристалл. Часто этот кристалл бывает токсином. Например, у энтомопатогенных Bacillus thuringiensis при спорообразовании к спорам прикрепляется токсин, — видимо, в надежде, что если это мертвое насекомое съестся другим, то оно тоже имеет шанс стать мертвым и, соответственно, кормить собой бактерии, которые выросли из этих спор.

После полного завершения этого процесса материнская клетка лизируется, и это тоже управляемый процесс, апоптоз (программируемая клеточная смерть), необходимый для того, чтобы не мешать зрелой споре цепляться за объекты, вести себя так, как ей положено, а не быть запертой в погибшем спорангии.

На протяжении всего этого процесса — пока что-то еще происходит в самой проспоре, пока ее метаболизм не отключен окончательно — из материнской клетки туда поступают необходимые вещества через специальные питательные трубочки. Эти питательные трубочки сохраняются в составе зрелой споры и, по-видимому, необходимы для процесса прорастания.

Зрелая спора может покоиться много времени. Она замечательно переносит высушивание, нагревание. Ставились даже довольно смешные эксперименты по попытке уронить камень с орбиты с помощью геофизических ракет либо прикрепить специальную керамическую пластинку к спускаемому аппарату, чтобы посмотреть, можно ли транспортировать споры на метеоритах, тестируя гипотезу панспермии. Оказалось, что если постараться, то это возможно.

Но когда эта множество раз высушенная, облученная, но все еще живая спора встречается с питательными веществами, она ухитряется почувствовать это с помощью специальных рецепторов, заложенных как механизмы замедленного действия в ее многочисленных стенках. Если сигнал достаточно сильный, то спора включает программу прорастания, которая в какой-то момент становится необратимой. Отчасти на этом основана история с дробной стерилизацией. Даже если спора не проросла, она может набухнуть водой, но не может снова стать спорой — ей необходимо сначала вырасти в клетку.

Первое, что она делает, — начинает выпускать из себя кальциевую соль дипиколиновой кислоты, чтобы можно было поглотить воду и запустить макромолекулярные синтезы. Интересно, что кальций ДПК тоже является сигналом, индуцирующим прорастание спор. Видимо, это нужно, чтобы, если много спор лежит в одном месте, они начинали прорастать одновременно и чтобы получилось сразу много вегетативных клеток. С помощью специальных ферментов разбираются клеточные оболочки, и с одного из концов споровые оболочки, за исключением внутренней пептидогликановой оболочки, которая лежит поверх мембраны, лопаются. Спора имеет шарообразную форму, а клетка — более вытянутую. Она начинает вырастать из споры, как из яйца, от которого отваливается крышечка. Обычно конец, из которого она вырастает, — это тот конец, который во время образования споры был направлен к центру материнской клетки.

Этот процесс совершенно завораживающий, и он является предметом активного изучения в течение многих лет. Сейчас известно очень большое количество подробностей о том, как это происходит. Они различаются у разных бактерий. По-видимому, весь этот процесс когда-то в древности имел общее происхождение, поскольку некие ключевые моменты системы, с помощью которой клетка принимает решение, делать ей спору или пока еще не стоит, у разных клеток общие. Прежде чем сделать спору, клетка должна подумать, можно ли справиться, например, с голоданием как-то иначе: сделать жгутик и уплыть, съесть окружающие клетки. Каннибализм у бацилл — это действительно некоторая мера, предшествующая спорообразованию. Если сигнал совсем сильный, она включается и начинает делать спору.

Детали (например, устройство внешних споровых покровов) могут кардинально различаться. Поэтому разнообразие молекулярных механизмов и красивых структур, которые можно увидеть в этом процессе, очень велико. Как и в любом другом процессе развития, здесь есть много взаимосвязей. Допустим, сеть регуляторных сигналов, которые могут быть избыточны по отношению друг к другу, на самом деле имеет достаточно консервативную общую канву. Таким загадочным образом некоторые грамположительные бактерии переносят экстремально неблагоприятные для себя условия.

Источник: postnauka